較深入研究蜜蜂屬分類的人當(dāng)屬Ruttner 博士，他對蜜蜂屬形態(tài)方面的多個指標(biāo)進(jìn)行了分析，此后很多人應(yīng)用他提供的分類體系對特定區(qū)域或品種的蜜蜂形態(tài)特征進(jìn)行研究。由于自然環(huán)境因素、蜂群內(nèi)部環(huán)境以及飼養(yǎng)管理手段等方面的影響，造成蜜蜂種內(nèi)的亞種或地理宗的個體間在外部形態(tài)上往往比較相似，給種內(nèi)的分類鑒別帶來困難；又由于蜜蜂的生物學(xué)特點(diǎn)，必須以群為單位進(jìn)行大樣本數(shù)和有效的統(tǒng)計學(xué)分析，使其成為一種繁重、低效的研究工作，所以利用形態(tài)特征進(jìn)行分析有很大的局限性。酶的多態(tài)性在對西方蜜蜂的研究中應(yīng)用比較多，目前只是對少數(shù)地區(qū)(巴基斯坦、泰國、馬來西亞、日本、菲律賓和朝鮮等)的東方蜜蜂進(jìn)行了同功酶方面的分析，并且只是研究MDH(蘋果酸脫氫酶)和EST(酯酶)的差別。至于我國的東方蜜蜂，僅對云南的樣本做過該方面研究。由于同功酶的特異性較差，此方法現(xiàn)在應(yīng)用較少。

近年來，隨著蜜蜂遺傳學(xué)和分子生物技術(shù)的發(fā)展，很多研究者已從分子水平上對蜜蜂群體進(jìn)行研究。從分子水平上分析蜜蜂群體的遺傳差異，目前主要采用DNA分子標(biāo)記技術(shù)，如RAPD、DNA指紋圖譜、微衛(wèi)星多態(tài)性以及RFLP等。這些技術(shù)可以反映生物的群體和個體特征，在估測蜜蜂的遺傳多樣性方面被廣泛應(yīng)用。

1．利用BAPD技術(shù)對東方蜜蜂群體結(jié)構(gòu)的分析

RAPD技術(shù)可以分析蜜蜂各品種、亞種之間的多態(tài)性。早期RAPD—PCR技術(shù)被用來檢測非洲化蜜蜂和歐洲蜜蜂的DNA，后來科研人員開始用RAPD技術(shù)研究東方蜜蜂。黃超群等N利用該技術(shù)對中華蜜蜂和意大利蜜蜂基因組DNA進(jìn)行多態(tài)性分析，并找到3條隨機(jī)引物，用于區(qū)別此兩種蜜蜂。董霞等對云南及馬來西亞的37個東方蜜蜂樣本進(jìn)行了隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA的分析。但是RAPD技術(shù)工作量大且重復(fù)性較差，目前在蜜蜂的群體結(jié)構(gòu)方面的研究中未能廣泛應(yīng)用。

2．利用BFLP技術(shù)對東方蜜蜂群體結(jié)構(gòu)的分析

線粒體DNA(mtDNA)是線粒體中的遺傳物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)較基因組DNA簡單。在多數(shù)動物品種中mtDNA為母系遺傳，因此在有多父系的生物物種間，利用mtDNA分析群體結(jié)構(gòu)更有優(yōu)勢。在蜂群中所有工蜂都是同一只蜂王的后代，所以一只工蜂的mtDNA基因型即可代表一個特定的蜂群，利用mtDNA對蜂群進(jìn)行研究是一種十分高效、準(zhǔn)確的手段。通過對mtDNA的多態(tài)性分析，可以了解群體的遺傳結(jié)構(gòu)、基因流失及系統(tǒng)發(fā)育方面的情況。

目前對蜜蜂線粒體的研究中，RFLP技術(shù)發(fā)揮著重要作用。其主要方法是利用PCR技術(shù)擴(kuò)增線粒體基因組片段，然后分析其限制酶切位點(diǎn)或序列的差異間。近期對蜜蜂線粒體基因組的研究焦點(diǎn)集中在細(xì)胞色素氧化酶C0Ⅰ-C0Ⅱ基因間的序列。在COⅠ-COⅡ之間，有tRNAleu基因和一個非編碼區(qū)，后者為蜜蜂屬所特有。因為它不編碼，所以進(jìn)化速度較快，可為亞種水平上的分析提供信息，蜜蜂線粒體DNA大小的差異主要集中在此非編碼區(qū)。

線粒體DNA是分析西方蜜蜂亞種間群體差異的有力工具。早在20世紀(jì)80年代末和90年代初一線粒體DNA的長度多態(tài)性就被用于區(qū)分美洲和歐洲的蜜蜂品種。東方蜜蜂和西方蜜蜂同樣具有tRNAleu與細(xì)胞色素氧化酶亞基COⅡ這一基因間序列，有高含量的A-T堿基，使得東方蜜蜂同樣可以利用RFLP技術(shù)進(jìn)行亞種內(nèi)的線粒體基因類型的檢測。Smith等首次對東方蜜蜂線粒體基因型的多態(tài)性進(jìn)行了研究，把東方蜜蜂分成三種類型：亞洲大陸型(分布在日本、泰國、馬來西亞、婆羅洲以及印度南部)、呂宋島類型和安達(dá)曼群島類型。隨后，Deowanish等用PCR技術(shù)擴(kuò)增了四種東方蜜蜂亞種的mtDNA的tRNAI-COⅡ基因間序列，并用10種限制性內(nèi)切酶對日本、中國臺灣、越南、泰國、尼泊爾和菲律賓等國家和地區(qū)22個地點(diǎn)的27群東方蜜蜂的mtDNA進(jìn)行分析，把東方蜜蜂分為6種類群，分別分布在(1)日本；(2)尼泊爾、越南和泰國的北部及中部；(3)朝鮮-對馬島；(4)中國臺灣；(5)泰國南部；(6)菲律賓。Sihanuntavong等擴(kuò)增了泰國東方蜜蜂線粒體的srRNA，1rRNA基因以及COⅠ-COⅡ基因的中間區(qū)域，在檢測的170群蜜蜂中發(fā)現(xiàn)了12種線粒體基因類型，在泰國的北部和泰國半島的東方蜜蜂中檢測到比較大的遺傳差異。

目前對東方蜜蜂的研究由于研究方法、樣品的采集地點(diǎn)和數(shù)量不同，分類結(jié)果存在諸多爭議，比如Ruttner根據(jù)形態(tài)指標(biāo)把日本蜜蜂單獨(dú)劃為一個亞種，而通過分子水平的分析Deowanish等認(rèn)為日本蜜蜂(A.c.japonica)屬于尼泊爾、越南及泰國類型，Smith則把日本蜂歸入亞洲大陸類型。

綜上所述，目前關(guān)于東方蜜蜂線粒體DNA的研究大多只測量了一些特定區(qū)域的少數(shù)樣本，而且沒有從中國以及喜馬拉雅的廣大地區(qū)收集樣品，所以測量結(jié)果不足以解釋東方蜜蜂群體的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。由于已有的研究采用的方法不同，結(jié)果沒有比較性，所以目前關(guān)于東方蜜蜂群體線粒體DNA的研究結(jié)果還沒有統(tǒng)一的認(rèn)識。

3．微衛(wèi)星標(biāo)記在東方蜜蜂群體多樣性方面的應(yīng)用

由于人們對西方蜜蜂的認(rèn)識比較深入，很多新技術(shù)也首先應(yīng)用到西方蜜蜂的研究中，Estoup等分析了西方蜜蜂群體中微衛(wèi)星位點(diǎn)的差異，后來Sittipraneed 從泰國的不同地區(qū)收集了蜜蜂樣本，用3個微衛(wèi)星位點(diǎn)分析了東方蜜蜂的群體差異，認(rèn)為泰國境內(nèi)由于地理環(huán)境的差異，東方蜜蜂群體可以進(jìn)行種內(nèi)的再劃分。

4．其他方法分析東方蜜蜂的群體多樣性

國外學(xué)者通過對蜜蜂線粒體DNA的ATPase6基因進(jìn)行序列分析，對西方蜜蜂的起源、系統(tǒng)分化等問題進(jìn)行了探討。王瑞武等擴(kuò)增、克隆了我國吉林、北京地區(qū)的中華蜜蜂線粒體DNA的ATPase6和ATPase8基因，測序后與已發(fā)表的序列進(jìn)行比較，對中華蜜蜂的起源和系統(tǒng)分化進(jìn)行探討，目的在于為中華蜜蜂的分類、保護(hù)及合理利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，結(jié)果提示ATPase6和ASTase8基因在蜜蜂亞種內(nèi)均屬于保守區(qū)，在種間有時出現(xiàn)變異。

總之，目前對于西方蜜蜂的研究較為深入，很多新技術(shù)和方法都已經(jīng)得到應(yīng)用，雖然東方蜜蜂與西方蜜蜂的親緣最近，但有關(guān)東方蜜蜂各亞種的遺傳變異方面的研究相對較少，特別是對中國境內(nèi)的東方蜜蜂的群體多樣性的研究基本還停留在形態(tài)測量水平上，很少涉及分子技術(shù)方面的應(yīng)用，國內(nèi)屬于空白領(lǐng)域。因此，從分子水平上對我國境內(nèi)的東方蜜蜂群體多樣性進(jìn)行研究，可以對中華蜜蜂進(jìn)行更準(zhǔn)確的分類，為深入了解我國的蜂種資源和蜂種的保護(hù)與利用提供重要依據(jù)。

參考文獻(xiàn)(略）

引自《中國蜂業(yè)》2006（2）

丁桂玲 張秀琳 呂麗萍 石巍

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所育種中心